Fluorimeter

Für den Verein AATiS (Arbeitskreis Amateurfunk und Telekommunikation in der Schule e.V.) verfasse ich ja regelmäßig Artikel zu meinen physikalischen Projekten. Im letzten Praxisheft Nr. 32 stieß ich auf einen Selbstbau eines Fluorimeters von Dr. Oliver Happel. Da mich der simple Aufbau begeistert hat beschloß ich umgehend, mir auch eines zu basteln.

Link zum AATiS Fluorimeter-Bausatz: https://www.aatis.de/content/bausatz/AS662_Fluorimeter

Hier der skizzierte Gesamtaufbau:

Ein Fluorimeter dient dazu, die Konzentration von fluoreszierenden Stoffen in einer Probe quantitativ zu erfassen. Hierzu wird die Probe mit Licht bestimmter Wellenlänge angeregt. Das Fluoreszenzlicht wird dann seitlich mittels eines Lichtsensors erfasst. Je höher die Konzentration des fluoreszierenden Stoffs, desto größer ist das erhaltene Signal vom Lichtdetektor. Damit nicht auch das Anregungslicht den Lichtsensor erreicht und dadurch für verfälschte Werte sorgt, wird in der Regel ein Filter zwischen Probe und Lichtsensor postiert. Dieser blockt dann das Anregungslicht wirksam ab.

Bildquelle: https://www.researchgate.net/publication/260228269_MULTI-PARAMETER_QUANTITATIVE_MAPPING_OF_MICROFLUIDIC_DEVICES/figures?lo=1

Bei der Fluoreszenz besitzt ja das Anregungslicht eine höhere Energie (höhere Frequenz f bzw. geringere Wellenlänge λ) als das dann emittierte Fluoreszenzlicht. Für Fluorescein (https://de.wikipedia.org/wiki/Fluorescein) verwende ich zum Beispiel konkret zur Anregung blaues Licht mit λ = 465 nm (Absorptionsmaximum: 485 nm), wohingegen das Maximum des Fluoreszenzlichts dann bei 514 nm liegt. Mittels Termschema ist dies einfach zu deuten: Das Anregungslicht hebt die Elektronen in einen angeregten Zustand. Von diesem aus „fallen“ die Elektronen ohne Zeitverzögerung in einen energetisch niedrigeren Zustand und dann weiter in den Grundzustand. Der letzte Sprung in den Grundzustand überspannt dann logischerweise eine geringere Energie als der ursprüngliche Sprung nach „oben“. Dadurch besitzt das Fluoreszenzlicht eine größere Wellenlänge als das Anregungslicht. Bei der Phosphoreszenz geschieht dies im grunde auch, nur verweilt dann das Elektron sehr lange in der Zwischenposition, bevor es über einen eigentlich verbotenen Übergang in den Grundzustand zurückkehrt. Dadurch wird im Gegensatz zur Fluoreszenz bei Phosphoreszenz noch sehr lange Zeit nach der Anregung Licht emittiert (sog. Nachleuchten).

Für das Fluorimeter werden folgende Teile benötigt:

  • 3/8″ T-Stück aus Messing
  • 2x Reduzierstücke von 3/8″ nach 3/4″ aus Messing
  • 2x Endkappen 3/4″ aus Messing
  • einen Lichtsensor, zum Beispiel den TSL252R
  • eine blaue (465 nm) bzw. UV-LED (365 nm) mit 3W Leistung
  • ein 4ml Glasgefäß mit den Abmessungen 15 x 45 mm mit Schraubverschluss
  • fluoreszierende Proben wie etwa Fluorescein oder Chinin

Die passenden 4mL-Glasgefäße wurden dankenswerterweise von der Firma Apothekenbedarf.at aus Wien gesponsert (https://www.apothekenbedarf.at/shop/produkte.html?area=Glasprodukte&subarea=Phiole#kontakt), vielen Dank nochmals für die tolle Unterstützung!

Der Betrieb des Lichtsensors TSL252R ist besonders einfach, da der Sensor nur eine Versorgungsspannung zwischen 2.7 und 5.5 V benötigt. Am Ausgangspin liegt dann eine zur Lichtintensität proportionale Spannung an, welche mit einem Voltmeter/Multimeter gemessen und notiert werden kann.

Möchte man mit dem Fluorimeter die Konzentration des fluoreszierenden Stoffs quantitativ erfassen, so muss die Intensität des Anregungslichts bekannt bzw. konstant sein. Denn je stärker das Anregungslicht, desto stärker natürlich auch das Fluoeszenzlicht bei sonst gleicher Konzentration des fluoeszierenden Stoffs in Lösung. Aus diesem Grund verwende ich eine Konstantstromquelle mit dem LM317. Die Stromstärke durch die LED ist somit reproduzierbar und konstant. Ich habe mich für 4 verschiedene Helligkeitsstufen/Ströme entschieden und zwar 357, 417, 500 und 625 mA. Laut Datenblatt können die 3W-LEDs in der Regel mit Strömen bis zu 700 mA betrieben werden. Betrieben wird die Schaltung mit einer einzelnen 18650 Liion-Zelle.

Hier einmal ein Test mit einer weißen 3W-LED in der höchsten Stufe:

Die Messing-Installationsteile sind mittlerweile auch schon aus Deutschland bei mir eingetroffen:

Als Filter kommt ein sog. JB490 zum Einsatz. Diesen erhält man günstig auf ebay. Idealerweise besitzt er eine Kreisform mit einem Durchmesser von 20 mm, damit er ohne jegliche Anpassung in das Messing-Reduzierstück passt. Der Filter blockiert im Idealfall vollständig das Anregungslicht und lässt das Fluoreszenzlicht ungehindert passieren. Bei Fluorescein liegen Anregungs- und Fluoreszenzwellenlänge sehr nahe beisammen, was die Sache nicht gerade leicht macht. Ich hoffe aber mit dem JB490-Filter das Anregungslicht bei 465 nm nahezu vollständig zu blockieren und dann das Fluoreszenzlicht ab ca. 500 nm bestmöglich zu erfassen.

Kleine Mengen Fluorescein erhält man günstig auch auf ebay.com:

Die Glasfläschchen von apothekenbedarf.at passen perfekt in das T-Stück und schließen oben auch sehr gut lichtdicht ab:

Den Lichtsensor habe ich bereits eingeklebt:

Inzwischen habe ich das Fluorimeter etwas ansprechender auf einer Holzplatte aufgebaut:

So, der Filter JB490 ist angekommen und ich konnte mit einem meiner Spektroskope die Transmissionskurve aufnehmen. Diese stimmt sehr gut mit dem Datenblatt überein und dürfte gut dafür sorgen, das blaue Anregungslicht vom Lichtsensor fernzuhalten.

Hier das Spektrum ohne Filter

und mit Filter

Damit erhielt ich folgende Transmissionskurve:

Die 465nm-LEDs sind mittlerweile auch aus China eingetroffen und so konnte ich Messungen mit Fluorescein machen.

Leider konnte ich die Menge an in Wasser bzw. 2-Propanol gelösten Fluorescein mit meiner Waage nicht bestimmen, da erstens die Menge wirklich sehr gering war (ich schätze so im Bereich um die 10 mg und weniger) und zweitens sich trotz der geringen Menge nicht das gesamte Fluorescein in Wasser gelöst hat. Daher machte ich nur eine rein qualitative Messung ohne Konzentrationsangabe. Wie man anhand der Messwerte sieht, scheint der Filter aber gut zu funktionieren und blockt das 465nm-Anregungslicht ausreichend ab.

 


Als zweite Probe habe ich Chinin untersucht. Dieses befindet sich zum Beispiel in einigen Erfrischungsgetränken wie Bitter Lemon. Da ich die Chininkonzentration im Getränk nicht kenne, muss ich vorerst mit willkürlichen Einheiten (engl. arbitrary units) arbeiten. Ich habe die Firma SPAR aber bereits kontaktiert um die Konzentration herauszufinden. Als Anregungslicht verwende ich bei Chinin eine UV-LED mit λ = 365 nm und einer Leitung von 3W. Da der Lichtsensor auch unterhalb von 400 nm noch empfindlich ist, müsste ich eigentlich einen UV-Filter zwischen Probe und Lichtsensor verwenden. Die folgenden Messungen habe ich aber ohne Filter durchgeführt. Aus diesem Grund liefert der Lichtsensor auch bei keiner Chininkonzentration (reines Wasser) aufgrund von Lichtstreuung eine Spannung.

Wie man anhand der Messwerte erkennen kann, steigt zunächst die Lichtintensität/Spannung leicht an bei abnehmender Chinin-Konzentration. Dies führe ich auf die stärkere Absorption des Anregungslichts bei sehr hoher Chinin-Konzentration zurück, sodass die Intensität in Probenmitte, dort wo der Lichtsensor sitzt, bereits abgenommen hat.

Bei niedrigeren Konzentrationen kann man aber einen annähernd linearen Zusammenhang zwischen Lichtintensität/Spannung und Konzentration erkennen. Die Kurven für die unterschiedlichen LED-Stufen/Helligkeiten unterscheiden sich prinzipiell kaum voneinander.

Selbst bei einer 1024-fachen Verdünnung ist bemerkenswerterweise noch eine vom reinen Wasser unterscheidbare Fluoreszenz feststellbar. Dabei dürfte es sich dann um Chininkonzentrationen im Bereich von 34 µg/l handeln, also um eine sehr geringe noch nachweisbare Konzentration. Dies ist vergleichbar mit einem Stück Würfelzucker (3.6 g) aufgelöst in einem Schwimmbecken mit 106 000 Liter mit den Abmessungen 11 x 8 x 1.2 m.